Cela fait deux ans que Peter Parker enfile son costume de superhéros afin de lutter contre la criminalité qui sévit dans les rues de New York. Cependant, il peine à trouver un équilibre dans sa vie... il arrive en retard à tous ses cours, il ne sait pas payer son loyer,... Mary Jane va bientôt épouser John Jameson, le fils de J. Jonah Jameson (le rédacteur en chef du Daily Bugle où Peter travaille pour quelques dollars en tant que photographe). De son côté, Harry Osborn cherche toujours à se venger de l'homme-araignée qu'il tient pour responsable de la mort de son père. Cependant, il redonne vie à la société Oscorp de son défunt père.

Dans le cadre d'un projet financé par Oscorp, Harry invite Peter à rencontrer le docteur Otto Octavius. Octavius est persuadé d'avoir découvert une source d'énergie aussi puissante et renouvelable que le soleil. Il a mis au point des bras mécaniques intelligents qui permettent de manipuler à distance la fusion. Peter dîne même avec Octavius afin de parler sciences pour un projet scolaire. Octavius présente son invention à Peter et Harry et quelques éventuels fournisseurs d'Oscorp. Mais l'expérience est un fiasco. Rosie, la femme d'Octavius, meurt pendant l'expérience et Otto est électrocuté. Les bras métalliques fusionnent alors avec le corps du scientifique. Spider-Man arrive à stopper la catastrophe de justesse et sauve la vie de Harry mais celui-ci est désormais ruiné à la suite de l'échec d'Octavius. Il devient alccolique et cherche désespérement à se venger du superhéros.



Alors qu'Octavius était en train de subir une opération qui allait le libérer de ses bras mécaniques, il tue involontairement les chirurgiens et s'échappe de l'hôpital. Octavius est contrôlé mentalement par les bras qui l'incitent à recréer son oeuvre qui a été interrompue par un seul et unique responsable : Spider-Man. Il braque une banque où se trouvaient par hasard tante May et Peter. Ayant enfilé son costume de Spider-Man, Peter combat Octopus, surnom du Docteur Octavius, mais celui-ci parvient à s'enfuir.



Peter commence à perdre ses pouvoirs. Il déçoit à plusieurs reprises Mary-Jane pour avoir manqué sa pièce, et subi la colère de Harry. Peter étant le seul à photographier Spider-Man, il le soupçonne de l'aider à se cacher. Il découvre également que Mary-Jane va bientôt de se marier avec le fils de son patron, Jameson. Peter voit ses pouvoirs disparaitre petit à petit et commence à croire que sa vie échoue à cause de son rôle de héros. Peter décide d'arrêter d'être un super-héros et jette son costume dans une poubelle (il sera récupéré quelques jours plus tard par Jameson, qui l'exposera comme trophée dans son bureau). Dès lors, Peter redevient un élève studieux et parvient à retrouver un équilibre de vie correct et tente de se rapprocher de Mary Jane, en vain.



Après avoir pris conscience que Spider-Man était utile à ville et surtout après avoir sauvé une petite fille dans un incendie sans ses pouvoirs, Peter pense à remettre son costume et reprendre son rôle de justicier. Pendant ce temps, Octavius et Harry passent un accord, Octavius cherche du Tritium, un élément indispensable pour son projet et seul Oscorp ( ou plutôt Harry ) en détient. Harry, quant à lui, veut que Spider-Man lui soit livré vivant afin d'assouvir sa vengeance.

Alors que Mary Jane et Peter boivent un verre afin de leur relation complexe, Octavius débarque et enlève Mary Jane. Il demande en contre partie que Peter aille chercher Spider-Man ( personne ne connaît la double identité de Peter) et Mary Jane sera épargnée. Ayant retrouvé pleinement ses pouvoirs, Peter reprend son costume dans le bureau de Jameson et part sauver MJ. Un violent combat contre Octopus s'engage sur un train en route, mais Octopus fuit et laisse Peter arrêter le train qu'il a rendu incontrôlable. Ayant enlevé son masque, les passagers ont découvert son visage mais, reconnaissants de les avoir sauvé et de pouvoir compter sur l'araignée sympa du quartier, ils jurent de n'en parler à personne et lui rendent son masque. Octopus revient, assomme Spider-Man et l'emmène chez Harry.



Harry donne alors le Tritium à Octavius pour lui avoir rendu service. Quand Harry retire le masque de Spider-Man, il découvre stupéfait que Peter endossait le rôle du super-héros depuis le début. Peter convainc Harry de le laisser partir afin de sauver New York et surtout Mary Jane. Peter va à l'entrepôt abandonné, affronte Octopus et sauve MJ ; elle découvre elle aussi que Peter est Spider-Man. Peter parvient à raisonner Octavius sur la folie de son expérience, qui va détruire la ville. Le Doc reprend le contrôle de ses bras et se sacrifie en noyant la source d'énergie dans le fleuve. Peter avoue alors à Mary Jane ses sentiments mais lui dit qu'ils ne pourront jamais vivre ensemble car son rôle de justicier passera toujours avant elle et que le danger est toujours trop présent dans sa vie de héros.




Harry, quant à lui, reçoit la visite de son défunt père via des hallucinations de son défunt père. Ce dernier lui exige de le venger même si Peter fut un temps son ami. Fou de rage, Harry lance la dague qu'il tenait dans le miroir du salon et découvre le laboratoire secret de son père truffé de technologies de pointe et d'armes machiavéliques. Il décide donc d'endosser le rôle de Nouveau Bouffon Vert.

Le lendemain, Mary Jane, qui devait se marier, renonce au dernier moment et retourne chez Peter pour lui avouer ses sentiments malgré les dangers qu'ils risquent. Peter et MJ finissent par s'embrasser. Pour finir, Peter enfile son costume pour punir le crime laissant MJ seule dans son petit studio.