Peter Parker a enfin trouvé l'équilibre qui manquait tant dans sa vie et veut se marier avec Mary Jane. Pendant une nuit au parc, alors que Peter et Mary Jane regarde les étoiles dans une toile que Peter a confectionné, une petite météorite s'écrase pas loin de leur position et se brise en deux parties. Une matière noire visqueuse, nommée le symbiote, s'en échappe et s'accroche à la mobylette de Peter.



Dans cette même nuit, Flint Marko s'échappe de la prison où il était détenu pour cambriolage afin de voir sa fille qui lui manque terriblement...Or, l'injonction d'éloignement obtenue par son ex-femme l'en empêche. Pourtant il retrouve sa jeune fille mais son ex-femme le voit dans la cuisine en train de prendre à manger. Elle lui demande de partir mais leur fille les retrouve dans la pièce. Flint lui dit qu'il l'aime et qu'il reviendra. Il s'en va en attendant une patrouille de police dans le quartier. Pendant sa fuite, il tombe dans un accélérateur de particules, qui transforme son corps en sable. Les représentants de la loi partent alors que Flint devient l'Homme-sable. Harry Osborn veut toujours venger la mort de son père et continue de tenir Spider-Man pour responsable. Il revêt son habit de Bouffon vert et se lance à la poursuite de l'araignée. Il finit par le trouver et l'affronte dans un duel sanglant en ville. Peter a réussi à assomer Harry avec un choc à la tête qui le rend amnésique à court terme, lui faisant temporairement oublier son envie de se venger de Spider-Man.




Quelques jours plus tard, un festival est organisé afin d'honorer Spider-Man pour acte de bravoure, il a sauvé la vie de Gwen Stacy, la fille du chef de police. Celle-ci, l'embrasse, ce qui provoque un différend entre Peter et Mary Jane. Pendant ce type, l’Homme-sable tente de voler un véhicule blindé contenant l'argent nécessaire pour soigner sa fille mais Spider-Man l’arrête. Le capitaine Stacy divulgue plus tard à Peter et sa tante May que Flint Marko est celui qui a tué Ben Parker, son oncle. L'autre voleur, celui mort accidentellement dans le premier film, n'était qu'un complice.



Peter n'a plus qu'une seule idée en tête, tuer Marko pour venger la mort de son oncle. Le symbiote se colle sur son costume pendant sommeil. Peter découvre que ce n’est pas seulement son costume qui a changé, mais également ses pouvoirs qui eux ont augmenté. Cependant, il ignore encore que ce costume noir le change psychologiquement et le rend plus violent, plus égoïste et plus enragé. Le symbiote fait remonter le côté le plus sombre de sa personnalité.




Le changement d'attitude de Peter l'éloigne de Mary Jane, qui peine à (re)lancer sa carrière d'actrice. Elle se console avec Harry qui est maintenant guéri de son amnésie. Il pousse Mary Jane à se séparer de Peter avec comme arrière pensée de faire souffrir Peter. Harry le rencontre dans un restaurant et avoue à celui-ci qu'il est de nouveau le petit ami de MJ. Plus tard, Peter le trouve chez lui, et avec l'aide de son costume noir, l'affronte dans un combat singulier, qui laisse le visage de Harry défiguré dû à l'explosion d'une grenade. Influencé par son costume, Peter humilie également le photographe Eddie Brock, qui avait vendu au Daily Bugle de fausses images mettant en scène Spider-Man en train de braquer une banque. Ce stratagème avait pour but de prendre la place de Peter comme pigiste au Daily Bugle. Eddie Brock est licencié pour faute grave à cause de Parker et jure de se venger de ce dernier.




Pour rendre Mary Jane jalouse, Peter emmène Gwen au Jazz, le night club où MJ travaille comme chanteuse et serveuse. Peter se bat ensuite avec les videurs et gifle Mary Jane. C'est à ce moment que Peter se rend compte que le costume l’a complètement changé. Il sort en courant de la boîte de nuit et va à la cathédrale Saint-Patrick afin de se débarrasser du symbiote. Au début, il ne peut retirer le costume, mais sans le vouloir, il frappe la grande cloche et la fait sonner. Ces vibrations affaiblissent le symbiote, permettant à Peter de se débarrasser de lui. Eddie Brock, se trouvait également dans la cathédrale, quand le symbiote lui tomba dessus et s'accrocha à lui. Le symbiote transmet à Eddie les pouvoirs de Peter, créant un double maléfique de Spider-Man : Venom. Eddie, s'étant rendu compte que Peter et Spider-Man sont la même personne, trouve l’Homme-sable et lui propose de s'associer avec lui pour détruire Spider-Man.



Ils utilisent Mary-Jane comme appât pour forcer Spider-Man à les affronter. Peter va demander son aide à Harry, mais celui-ci refuse catégoriquement. Cependant, Harry apprend la vérité au sujet de la mort de son père grâce à son majordome (il a été tué par son propre planeur et non par Spider-Man). Peter était en possition de faiblesse face à deux de ses ennemis les plus coriaces qu'il ait affronté quand Harry arrive à temps pour sauver Peter, s'associant à lui contre Venom et l’Homme-sable. À un moment dans le combat, Brock essaye d'empaler Peter, mais Harry s'interpose et est mortellement blessé... Peter se rappelle alors que les vibrations de la cloche de l’église avaient affaibli le symbiote. Peter enferme Eddie/ Venom dans un cercle de tuyaux et les fait résonner en frappant dessus. Le symbiote criant de souffrance finit par libérer Eddie contre son gré. Peter jette une bombe-citrouille au symbiote afin de le détruire une bonne fois pour toute mais Eddie se lance vers le symbiote et meurt avec lui...



Après la bataille, Marko dit à Peter qu'il n'avait eu aucune intention de tuer Ben Parker. Marko l'avait fait sortir de sa voiture pour la lui voler après le braquage. Ben tentait de le convaincre de rentrer chez lui plutôt que de continuer sur cette voie. Le complice de Marko, celui que Peter avait laissé partir, est arrivé et lui a accidentellement fait presser la détente de son arme, tuant donc Ben et laissant Marko rongé par les remords d'avoir tué un innocent qui li voulait du bien. Peter pardonne à Marko, qui s'envole au loin dans une nuée de sable. Peter et Harry se pardonnent mutuellement, avant qu'Harry ne meure de ses blessures. Après l'enterrement de Harry, Peter et Mary Jane se retrouvent et reprenent la relation qu'ils avaient laissée tomber.